BioTech：新型耐盐细菌的分离与生物分子生产：来自盐渍环境的功能微生物资源
BioTech：新型耐盐细菌的分离与生物分子生产：来自盐渍环境的功能微生物资源
论文标题：Novel Halotolerant Bacteria from Saline Environments: Isolation and Biomolecule Production
论文链接： https://www.mdpi.com/2673-6284/14/2/49
期刊名： BioTech
期刊主页： https://www.mdpi.com/journal/biotech
一、引言
盐渍环境（如盐湖、盐井、盐沼和盐渍土壤）长期被认为微生物多样性较低，但近年研究发现，其中蕴藏着大量具有特殊生理适应机制和生物技术潜力的微生物资源。耐盐和嗜盐细菌为了适应高渗透压、高离子强度和剧烈波动的环境条件，进化出了独特的代谢途径和生物分子合成能力，可产生胞外水解酶、生物表面活性剂、类胡萝卜素色素和胞外多糖等高价值产物，在生物修复、工业生物催化、医药和可持续生物制造等领域具有广阔应用前景。然而，目前对许多未被充分探索的盐渍生境中可培养耐盐细菌的多样性及其生物分子生产能力仍缺乏系统认识。基于此，本研究从罗马尼亚 Prahova 县 B?icoi 和 Curm?tura 两处盐井的土壤、水和泥样中分离获得四株新型耐盐细菌，并系统评估了其耐盐特性、烃类耐受性以及胞外水解酶、生物表面活性剂和类胡萝卜素色素的生产能力，旨在为盐渍环境微生物资源的开发与利用提供新的科学依据。
二、材料与方法
研究样本于 2024 年 7 月采自罗马尼亚 Prahova 县 B?icoi 和 Curmatura 的两处盐井，包括土壤、水和泥样。采样后立即送回实验室，测定温度、pH、密度、盐度和氯离子含量等理化指标。采用两种选择性培养基进行耐盐菌分离：MH 培养基（NaCl 100 g/L）和 JCM 168 培养基（NaCl 200 g/L）。通过梯度稀释和平板涂布法分离纯化菌株，并置于 30°C 和 37°C 条件下培养。对分离获得的菌株进行表型特征（菌落颜色、革兰氏染色、细胞形态、运动性、呼吸类型、过氧化氢酶和氧化酶活性等）和分子特征（16S rRNA 基因扩增与测序、RAPD 指纹图谱）鉴定。进一步评估了四株菌在不同 NaCl 浓度（0–5 M）下的生长动力学和细胞活力，并通过烃类覆盖琼脂法和液体培养法测定其对柴油、煤油、正己烷和正十六烷的耐受性。采用平板法（plate assay）检测胞外水解酶活性（脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶），通过乳化指数、亚甲基蓝法、CTAB 琼脂平板和 HPTLC 分析生物表面活性剂生产，利用 UV-Vis 光谱和 HPTLC 分析类胡萝卜素色素，并采用 spot-on-lawn 法评估生物表面活性剂和色素提取物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌活性。
三、分析与结果
从 30 株纯培养物中筛选出 4 株形态差异明显的菌株 SB8、CN6、CN8 和 IB5，经 16S rRNA 基因测序和系统发育分析，分别鉴定为 Halomonas elongata SB8、Bacillus altitudinis CN6、 Planococcus riftoensis CN8 和 Halomonas stenophila IB5。其中 SB8 和 IB5 为革兰氏阴性菌，CN6 和 CN8 为革兰氏阳性菌，菌落颜色从奶油色、米色到橙色不等。四株菌均能在无额外 NaCl 的 MH 琼脂上生长，确认其耐盐特性。 H. elongata SB8 耐盐能力最强，可在 0–4 M NaCl 琼脂上生长，在 0–3 M NaCl 液体培养基中生长良好，细胞活力可维持至 5 M NaCl； H. stenophila IB5 在 0–3 M NaCl 范围内生长，细胞活力同样可达 5 M NaCl；而 B. altitudinis CN6 和 P. riftoensis CN8 耐盐范围较窄，分别为 0–2 M 和 0–3 M NaCl。在烃类耐受性方面，H. elongata SB8 对所有测试烃类均表现出高耐受性，在柴油、煤油、正己烷和正十六烷存在下均可生长； B. altitudinis CN6 对柴油、正己烷和正十六烷耐受性良好； P. riftoensis CN8 仅耐受正己烷和正十六烷； H. stenophila IB5 对柴油和正十六烷具有耐受性，但完全被煤油抑制。
图 1. 从高盐样品中分离耐盐细菌及其表征。
(a) 来自 Baicoi 的土壤和水样，以及来自 Curmatura 盐井（SW）的泥样。
(b) 菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）在 JCM168 和 MH 培养基上的生长情况。
(c) 使用细菌引物（27f/1492r）或古菌引物（20f/1492r）对菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）的 gDNA 进行 16S rRNA 基因 PCR 扩增；使用 AP12 引物对菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）的 gDNA 进行 RAPD 分析；1 kb DNA ladder（M）。
图 2. 耐盐细菌对盐的耐受性。
(a) 菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）在含 0–5 M NaCl 的 MH 琼脂上的生长情况。
(b) 菌株 SB8、CN6、CN8 和 IB5 在含 0–5 M NaCl 的 MH 液体培养基中的生长动力学。
图 3. 嗜盐菌对烃类的耐受性。
(a) 菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）在覆盖或不覆盖烃类的 MH 琼脂上的生长情况。
(b) 菌株 SB8、CN6、CN8 和 IB5 在添加或不添加 10% 烃类的 MH 液体培养基中的生长动力学。
在生物分子生产方面， B. altitudinis CN6 表现出最广泛的胞外水解酶活性，可产生脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶，其中脂肪酶水解圈直径超过 15 mm； H. stenophila IB5 产生蛋白酶、纤维素酶和木聚糖酶； H. elongata SB8 具有脂肪酶和淀粉酶活性； P. riftoensis CN8 具有蛋白酶和纤维素酶活性，所有菌株均未检测到果胶酶活性。在生物表面活性剂生产方面， H. elongata SB8 和 B. altitudinis CN6 的乳化指数达到 100%，亚甲基蓝法吸光度分别为 1.94 和 1.50；HPTLC 分析显示所有菌株均产生含脂质和糖基组分的生物表面活性剂，Rf 值范围为 0.37–0.72。抗菌实验表明，所有生物表面活性剂提取物均对大肠杆菌具有抑制作用，部分提取物对铜绿假单胞菌和白色念珠菌也有活性，但对金黄色葡萄球菌均无抑制作用。在类胡萝卜素色素生产方面， P. riftoensis CN8 总类胡萝卜素浓度最高（453.44 μg/mL），其次为 H. stenophila IB5（162.80 μg/mL）、 H. elongata SB8（64.96 μg/mL）和 B. altitudinis CN6（15.76 μg/mL）。所有色素提取物均对白色念珠菌表现出抗真菌活性， H. elongata SB8 和 H. stenophila IB5 的色素提取物还对大肠杆菌和铜绿假单胞菌具有抑制作用。
图 4. 耐盐细菌的生物表面活性剂生产。
(a) 菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）在 MH 液体培养基中生长的生物表面活性剂提取物的 TLC 分析；阻滞因子（Rf）；标准品（S，L-鼠李糖）；TLC 板在可见光下观察并扫描。
(b) 菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）提取的生物表面活性剂对病原微生物的抗菌活性。
图 5. 耐盐细菌的类胡萝卜素色素生产。
(a) 菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）在 MH 液体培养基中生长的类胡萝卜素提取物的 TLC 分析；阻滞因子（Rf）；类胡萝卜素标准品（S）；TLC 板在紫外光下观察。
(b) 类胡萝卜素的 UV-Vis 光谱（300–550 nm）。
(c) 菌株 SB8（1）、CN6（2）、CN8（3）和 IB5（4）提取的类胡萝卜素对病原微生物的抗菌活性。
四、讨论
本研究从两处未充分探索的盐井环境中分离获得四株具有不同耐盐特性和生物分子生产能力的耐盐细菌，丰富了我们对盐渍环境可培养微生物多样性的认识。四株菌在耐盐范围、烃类耐受性和代谢产物谱方面表现出明显的种间和株间差异，说明盐渍环境中的微生物适应策略具有高度多样性。 H. elongata SB8 兼具高耐盐性和广谱烃类耐受性，是生物修复应用的潜在候选菌株； B. altitudinis CN6 具有最广泛的胞外水解酶谱，在生物催化和生物质降解方面具有应用潜力； H. elongata SB8 和 B. altitudinis CN6 均可产生高乳化活性的生物表面活性剂，显示出在石油烃污染环境修复中的应用前景； P. riftoensis CN8 可产生高浓度类胡萝卜素，并具有抗真菌和抗细菌活性，在医药和化妆品领域具有开发价值。值得注意的是，部分菌株在固体和液体培养条件下的表现存在差异，这可能与营养物质扩散、氧气可用性和烃类生物利用度等因素有关。此外，生物表面活性剂和色素提取物的抗菌活性具有菌株特异性和靶标特异性，其具体作用机制仍需进一步研究。
五、展望与结论
本研究揭示了来自盐渍环境的耐盐细菌在生物分子生产方面的巨大潜力。四株新分离菌株 H. elongata SB8、 B. altitudinis CN6、 P. riftoensis CN8 和 H. stenophila IB5 能够产生胞外水解酶、生物表面活性剂和类胡萝卜素色素等多种高价值生物分子，在生物修复、工业生物催化、医药和可持续生物制造等领域具有广阔应用前景。
未来研究可进一步优化培养条件以提高目标代谢产物产量，深入解析生物活性化合物的化学结构和合成机制，并评估这些菌株在实际工业和环境场景中的应用可行性与安全性。随着对盐渍环境微生物资源研究的不断深入，耐盐细菌有望成为绿色生物制造和可持续生物技术的重要微生物底盘。
期刊介绍
主编：Prof. Dr. Massimo Negrini
期刊发表范围涵盖生物制药领域, 通过培育 转基因 植物、动物或水生生物来解决农业中食品的生产或质量问题，以及在医学领域中采用的新方法；在环境领域中的应用，旨在维护生物多样性并清除污染物；开发能够生产有用化学物质或销毁有害/污染化学物质的生物体或酶；生物信息学方法；以及与生物技术领域中的伦理、哲学和监管方面相关的论文。被ESCI、Scopus、PubMed、PMC等多个权威数据库收录。在JCR Biotechnology and Applied Microbiology 类别排名中位居Q2.
2025 Impact Factor：3.6
2025 CiteScore：5.6
Time to First Decision：20.7 Days
Acceptance to Publication：3.2 Days